Az ujjbegyből vagy a fülcimpából nyert kapilláris vér (egyre ritkábban alkalmazott eljárás) vagy alvadásgátlóval (EDTA) kezelt vénás vér egy cseppjét zsírtalanított, tiszta tárgylemez közepére helyezzük, 1-2 cm-re egyik végétől. A kikenésre szolgáló lemezt 30-40°-os szögben tartva az alaplemezen hátrafelé húzzuk, míg elérjük a cseppet, mely a lemez éle mentén szétfut. Ekkor határozott, gyors mozdulattal a kikenő lemezt előre toljuk, a csepp 3-4 cm hosszú, vékony réteg formájában terül szét. A kenetet úgy kell készítenünk, hogy a kezdetben vastag réteg fokozatosan vékonyodjék, így biztosan lesz olyan terület, mely a vizsgálatra alkalmas.
Az így elkészített kenet rutin laboratóriumi célokat szolgáló festése többféle módon történhet. Magyarországon a May-Grünwald-Giemsa (Pappenheim) festés terjedt el. Az alkalmazott festékek a methylenkék, ill. ennek savas bichromáttal aktivált formája, a methylen azúr, és az eosin keverékéből állnak. Az oldószer methylalkohol. A methylen azúr ibolyakék szinű, és a savanyú vegyhatású sejtalkotórészeket, mint a mag, illetve a cytoplasma RNS-e festi meg. Az eosin színe vörös, az erősebben bázikus komponensekhez kötődik (pl. hemoglobin). A neutrophil granulocyták granulumai enyhén bázikus vegyhatásuk révén gyengén festődnek az azúr komponenssel. Az eosinophil sejtek erősen bázikus sperminszármazékokat tartalmazó szemcséi az eosinnal, míg a basophil sejtek granulumai, melyek savas vegyhatású heparint tartalmaznak, a bázikus komponenssel festődnek.
A kenetek festését a May-Grünwald és a Giemsa oldatokkal végezzük, melyeket tömény, illetve hígitott állapotban különböző ideig hagyunk a keneten. A festés akkor ad jó eredményt, ha minden új festékkiszereléshez meghatározzuk a legmegfelelőbb hosszúságú festési időt.
A festett vérkenet mikroszkópos vizsgálatakor kikeresünk egy olyan területet, melyen a vörösvérsejtek nem fedik el egymást, de nincs közöttük nagyobb üres terület, széleiken érintkeznek egymással. A vizsgálatot - áttekintés céljából - kis nagyítással kezdjük, majd százszoros nagyítású immerziós objektívvel és tízszeresen nagyító szemlencsével (ezerszeres nagyítás) végezzük.
Figyelembe véve, hogy kikenéskor a fehérvérsejtek eloszlása nem egyenletes (a lymphocyták aránya nagyobb a középső, a granulocytáké és a monocytáké pedig a széli részeken) a vizsgálatot úgy végezzük, hogy középső és széli területeket is azonos arányban lássunk.
Megvizsgáljuk a vörösvérsejtek nagyságát, alakját, színét, keressük az esetleg jelenlevő zárványtesteket.
Normálisan a kenetben a vörösvérsejtek átmérője 7,2-7,9 µm (megfelel az érett, kis lympocyta magjának), alakjuk kerek, középen a sejt átmérőjének kb 1/3-át kitevő halványabb területtel, színük rózsaszín, zárványtesteket nem tartalmaznak.
Az egyes fehérvérsejtféleségek előfordulási arányának megállapításához (minőségi, qualitatív vérkép) általában 100 fehérvérsejtet számolunk meg. A normális megoszlási arányt mutatja a következő táblázat.
| A fehérvérsejtek normális megoszlása felnőttben | ||||
|---|---|---|---|---|
| % | abszolút szám | |||
| (ezer/µl) | ||||
| Granulocyták | ||||
| neutrophil | ||||
| fiatal (Jugend) | 0-1 | 0,0-0,1 | ||
| pálcika (Stab) | 3-8 | 0,3-0,7 | ||
| karélyos (Segment) | 45-73 | 1,3-6,7 | ||
| eosinophil | 0-4 | 0,0-0,3 | ||
| basophil | 0-1 | 0,0-0,1 | ||
| Lymphocyta | 18-44 | 0,9-3,2 | ||
| Monocyta | 3-8 | 0,1-0,6 | ||
A fehérvérsejtek vizsgálata után megbecsüljük a vérlemezkék számát és vizsgáljuk azok morfológiáját.
A vérkenet sejtjeinek cytokemiai vizsgálatával, a különböző sejtvonalak jobban felismerhetők és elkülöníthetők egymástól, mint a May-Grünwald-Giemsa festéssel. Ezek közül a gyakrabban alkalmazottak:
Peroxidase: A neutrophil és az eosinophil granulocyták nagy mennyiségben tartalmaznak egy enzimet, a myeloperoxidaset, amely enzim nem mutatható ki a lymphocytákban és a vörösvérsejt előalakokban. A reakció alapja a benzidin hydrogenperoxid által történő oxidációja, ami rézszulfát jelenlétében kékeszöld elszíneződést eredményez (újabban - a benzidin feltételezett carcinogen hatása miatt - más anyagokat is használnak).
Aspecificus esterase: A szubsztrát alpha-naphtyl butirat, a reakció a perifériás vér magvas elemei közül a monocytákban pozitív (kisebb mértékben az aktivált T lymphocytákban). A csontvelői sejtek közül a histiocyták, a macrophagok és a megakaryocyták adnak pozitív reakciót.
Acid phosphatase: Valamennyi haemopoeticus sejtben jelen van. Kimutatására számos módszer szolgál. Tartarát rezisztens izoenzim jelenléte leukémiás sejtekben hajassejtes leukémiára utal.
Perjódsavas-Schiff (PAS) reakció: Az intracellularis glykogen kimutatására szolgál. Csaknem valamennyi haemopoeticus sejt tartalmazza, de változó mennyiségben és elrendeződésben, így a reakció - bizonyos határok között - alkalmas azok egymástól való elkülönítésére.
Granulocyta alkalikus phosphatase (GAP): Több haemopoeticus sejtben előforduló enzim. A granulocytákban változó mennyiségben van jelen. A sejtenkénti aktivitást a cytokémiai reakció elvégzését követő mikroszkópos vizsgálat során számokkal (0-4) jelölik. 100 sejtet számolnak meg, így az aktivitás 0 és 400 közé eshet. Normál érték: 15-130.
Berlini kék reakció: A vas a sejteken belül ferritin vagy haemosiderin formájában raktározódik, és a reagensben lévő savanyú ferrocyanid ionokhoz kötődve kékeszöld szemcsék formájában látható a kenetben. Az eljárás felhasználható a vas kimutatására magvas vörösvérsejtekben (sideroblastok) és a histiocytákban (reticuloendothelialis vas). A vizsgálat végzésére elsősorban a csontvelő kenetek alkalmasak.
Immunofluorescens festések: Az egyes sejtek felszínén előforduló antigének (markerek) kimutatására és ezáltal a sejtek differenciálására szolgáló eljárás.
A direkt módszerrel az antigént fluorochrommal jelölt antitesttel azonosítjuk - fluorescens mikroszkóp alatt ,-míg az érzékenyebb indirekt módszer alkalmazásakor a jelzetlen elsődleges antitestet visszük fel a sejtekre. A fluorochromhoz kötött második antitestet (anti-immunoglobulin), mely az elsődleges antitesthez kötődik, ez után alkalmazzuk. A technikákat leggyakrabban suspendált sejtek vizsgálatára alkalmazzák fluorescens mikroszkóppal vagy "flow cytometer"-rel, amely műszer a sejtpopulációkat monochromaticus (laser) sugarat szóró tulajdonságuk alapján különíti el. Ez a sejtek nagyságától, granuláltságától és - a fenti eljárások alkalmazása esetén - a felszínükön elhelyezkedő antigének által megkötött antitestektől függ.
Immunoenzimatikus eljárások: Haematologiai kenetek vizsgálatakor az immuno-alkalikus phosphatase (IAP) technika vált a legelterjedtebbé. Az eljáráskor a specifikus antitestet nem fluoreszkáló festékkel, hanem egy enzimmel - jelen esetben ez az alkalikus phosphatase - jelölik. A kötődés helyét és mértékét az enzim substratjának hozzáadása és megfelelő festés után fénymikroszkóppal lehet meghatározni.
A csontvelő cytologiai vizsgálata kenet készítésével válik lehetővé. A kenethez szükséges vizsgálati anyagot felnőttnél valamelyik lapos csontból (a sternum corpusából ill. a crista ileiből), kisgyermekeknél a tibia tuberositas alatti részéből nyerjük e célra készített speciális tűvel aspiratio útján.
Tekintettel arra, hogy a különböző haemopoeticus sejtek egymáshoz való aránya a csontvelő különböző területein hasonló, az egy helyről nyert vizsgálati anyag bizonyos határok között az egész velőállományt reprezentálja (a ritka gócos elváltozások kivételével).
Az aspirátumot - mely vért és zsírba ágyazott kisebb-nagyobb (1-3 mm) velőrészeket tartalmaz - többféle módon kenhetjük ki, fontos az, hogy a sejtek egymástól jól elkülönüljenek. Szükséges tehát, hogy a kenet elég vékony legyen, de a kikenéskor a sejtek nem szabad sérüljenek, s a haemopoeticus sejtek vérrel való keveredését is el kell kerülni.
A csontvelő kenetet rutin célokra ugyanazokkal az eljárásokkal festhetjük, mint a perifériás vérkenetet. Tekintettel arra, hogy ezek a kenetek általában vastagabbak, mint a vérkenetek, festésük valamivel hosszabb időt vesz igénybe.
A May-Grünwald-Giemsa módszerrel festett kenetben kisebb nagyításokkal vizsgáljuk a velő sejtdússágát, a zsír és a vérképző sejtek mennyisége közötti arányt és a megakaryocyták számát. Nagyobb nagyítással vizsgáljuk az egyes vérképzőrendszerek (granulopoesis, erythropoesis, lymphoplasmocellularis rendszer) magvas elemeinek százalékos megoszlását, illetve az egyes rendszereken belül a fiatalabb és érettebb alakok egymáshoz való arányát (myelogram).
A számbeli viszonyok mellett vizsgáljuk az esetleges morfológiai eltéréseket, a mag, illetve plazma atypiákat (pl. megaloblastok), illetve a csontvelő- idegen sejteket (pl. szolid tumorok csontvelői áttétei).
Szövettani vizsgálathoz a spina iliaca anterior superiorból vagy posterior superiorból nyerhetünk biopsiás anyagot az erre a célra gyártott speciális tűvel. A biopsia eredménye egy kb 2x10-20 mm nagyságu szövethenger, mely a csontvelőt a csont szivacsos állományába ágyazva tartalmazza. A praeparatumból szövettani metszeteket készítenek és azokat mikroszkóp alatt vizsgálják.
A biopsia előnye az aspiratioval szemben, hogy olyan eltéréseket is kimutathatóvá tesz, melyek aspiratioval nem kórismézhetők (pl osteomyelosclerosis). Lehetővé teszi továbbá az egyes elemek elhelyezkedésének megállapítását a csont szerkezetén belül, ami pl a lymphomák diagnosztikájában lehet fontos. Kimutathatóvá tesz olyan sejteket, melyek aspiratioval nem távolíthatók el helyükről és így nem vizsgálhatók (pl hajassejtes leukaemiában vagy szolid tumorok csontvelői áttéteinél stb.). Hátránya, hogy a beteg számára nagyobb megterhelést jelent, s nem alkalmas az egyes sejtek finomabb szerkezetének vizsgálatára.
A csontvelőkenet és a histologiai vizsgálat céljára nyert anyag vizsgálható mindazokkal a cytokemiai és immunocytologiai eljárásokkal is, melyeket a perifériás vérkenet vizsgálatánál említettünk.
| A csontvelő sejtes összetétele (myelogram) egészéges felnőttekben | |||
|---|---|---|---|
| átlag (%) | határértékek (%) | ||
| Neutrophil granulocyták | 53,6 | 49,2-65,0 | |
| Myeloblast | 0,9 | 0,2-1,5 | |
| Promyelocyta | 3,3 | 2,1-4,1 | |
| Myelocyta | 12,7 | 8,2-15,7 | |
| Metamyelocyta | 15,9 | 9,6-24,6 | |
| Pálcikamagvú | 12,4 | 9,5-15,3 | |
| Karélyos magvú | 7,4 | 6,0-12,0 | |
| Eosinophyl granulocyták | 3,1 | 1,2-5,3 | |
| Myelocyta | 0,8 | 0,2-1,3 | |
| Metamyelocyta | 1,2 | 0,4-2,2 | |
| Pálcikamagvú | 0,9 | 0,2-2,4 | |
| Karélyos magvú | 0,5 | 0,0-1,3 | |
| Basophil és hízósejtek | 0,1 | 0,0-0,2 | |
| Erythroid sor | 25,6 | 18,4-33,8 | |
| Proerythroblast | 0,6 | 0,2-1,3 | |
| Basophil normoblast | 1,4 | 0,5-2,4 | |
| Polychromatophil nblast | 21,6 | 17,9-29,2 | |
| Orthochromasias nblast | 2,0 | 0,4-4,6 | |
| Lymphocyták | 16,2 | 11,1-23,2 | |
| Plasmocyták | 1,3 | 0,4-3,9 | |
| Monocyták | 0,3 | 0,0-0,8 | |
| Megakaryocyták | 0,1 | 0,0-0,4 | |
| Reticulum sejtek | 0,3 | 0,0-0,9 | |
| G/E (granulo-erythro-poeticus) arány | 2,3 | 1,5-3,3 | |